I ricercatori della University of California hanno ottenuto la prima ricostruzione della struttura tridimensionale di uno degli strumenti di editing genomico più promettenti
CRISPR si è evoluta in pochi anni: 8 anni fa è stato pubblicato l’articolo rivoluzionario firmato da Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier, che per prime hanno descritto il sistema di editing genomico Crispr-Cas9. Questa prima versione di CRISPR, la cosiddetta “forbice molecolare”, è stata seguita poi dal base editing e dal prime editing. Il base editing può essere considerato il “modello” CRISPR del 2017, in cui sono state eliminate le forbici molecolari e attivato un meccanismo di correzione che non taglia la doppia elica del DNA. I ricercatori di Berkeley (University of California) - tra cui Jennifer Doudna e David R. Liu, anche lui tra i primi a studiare CRISPR – hanno ora scoperto la struttura 3D del complesso di base editing.
I base editor sono già utilizzati nei tentativi di correzione di mutazioni di singoli nucleotidi nel genoma umano. Questi strumenti sono così evoluti che la conversione da adenina a guanina e da citosina a timina (i nucleotidi, ovvero le lettere che compongono il DNA) potrebbero potenzialmente correggere circa il 60% di tutte le malattie genetiche conosciute causate dalla mutazione di un singolo nucleotide, cioè circa 15mila patologie ereditari. Avere una struttura tridimensionale di riferimento fornisce una base fondamentale per rendere questo strumento più preciso, malleabile e controllabile. Il modello 3D è stato pubblicato il 31 luglio su Science. "Siamo stati in grado di osservare per la prima volta un base editor in azione", ha commentato Gavin Knott dell'Università di Berkeley. "Ora possiamo capire non solo quando funziona e quando non funziona, ma anche progettare la prossima generazione di editor per renderli ancora migliori e clinicamente più appropriati".
Questi strumenti di editing genomico utilizzano la proteina Cas9, che fa parte del “primo modello di forbice molecolare”, ma in una versione parzialmente disattivata: infatti, le sue forbici non riescono più a tagliare la doppia elica di DNA, ma possono tagliare solo un filamento nei pressi della mutazione bersaglio. Cas9 conferisce la specificità e una deaminasi, enzima che modifica chimicamente alcuni nucleotidi del DNA, si occupa dell’attività di correzione da adenina a guanina. Dato che lo studio si focalizza sulla proteina Cas9, queste nuove informazioni potrebbero aiutare a guidare l’ideazione di molti altri strumenti di editing genomico basati su questa proteina, considerata tra le più vantaggiose. Nel 2016, Liu aveva combinato Cas9 con un’altra proteina batterica per consentire una sostituzione precisa di un nucleotide con un altro. La prima versione di correzione per l’adenina era lenta, ma la nuova versione – chiamata ABE8e – è molto veloce e completa quasi il 100% delle modifiche previste in 15 minuti. La struttura di ABE8e, infatti, presenta due mutazioni specifiche nella proteina deaminasi che la fanno funzionare più velocemente rispetto alla prima versione perché permettono al complesso di legarsi più saldamente al DNA e di sostituire efficacemente la adenina con la guanina. D’altro canto però, questa maggiore velocità comporta una minore precisione, infatti questa nuova versione ha un rischio maggiore di modifiche non desiderate (chiamate mutazioni “off target”) e ciò è dovuto al fatto che Cas9 “salta” lungo il DNA prima di trovare la corrispondenza perfetta. Quindi può capitare che la deaminasi agisca prima, in uno dei punti di appoggio temporanei.
Per quanto riguarda la tecnica con cui è stata scoperta la struttura del base editor, si tratta di una tecnica di imaging ad alta potenza chiamata microscopia crioelettronica (crioEM). Questo tipo di microscopia elettronica a trasmissione utilizza le temperature criogeniche per poter osservare le macromolecole biologiche nella loro conformazione nativa, senza coloranti o fissanti. Vedere in modo preciso come le varie parti della struttura sono collegate tra loro può essere d’aiuto nel progettare lo strumento di editing genomico per renderlo attivo solo quando si lega al bersaglio. Inoltre, permetterà la comprensione dei meccanismi di funzionamento all’interno della cellula, così da migliorarlo sempre di più.
