Si chiama CRISPRoff e permette di spegnere i geni in maniera reversibile: il nuovo profilo di espressione genica permane per oltre 450 divisioni cellulari, senza modificare il DNA
La tecnica Crispr-Cas9 consente di modificare la sequenza di un gene e, in questi ultimi anni, i ricercatori stanno ideando sistemi sempre più precisi e regolabili. Ad esempio, esistono versioni di CRISPR che accendono e spengono i geni per mezzo di modificazioni epigenetiche, più sicure e reversibili. Gli interruttori epigenetici, infatti, cambiano la chiave di lettura dei geni ma lasciano immutata la loro sequenza. Un sistema di questo tipo è stato messo a punto da un team statunitense di ricercatori. Funziona proprio come un interruttore, in due versioni: CRISPRoff spegne i geni, CRISPRon li riaccende. Ma al contrario dei sistemi precedenti, CRISPRoff crea anche una memoria epigenetica ereditabile, che viene tramandata alle cellule figlie. Lo studio è stato pubblicato ad aprile sulla rivista Cell.
LA VERSIONE STANDARD CRISPR
Il sistema Crispr-Cas9 è, ad oggi, la più famosa e versatile tecnologia per la modifica del genoma e per la quale Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier hanno conquistato il Nobel per la Chimica dello scorso anno. Nella sua versione standard, il sistema CRISPR è composto da una proteina, Cas9, che taglia il DNA e da un filamento di RNA guida, che la conduce fino alla sequenza bersaglio. Dopo il taglio la cellula ha due strade: la prima è ricongiungere le estremità tagliate, un meccanismo che genera errori, tipicamente delezioni, nella sequenza del gene. L’altra possibilità è la ricombinazione omologa, meno soggetta a errori poiché usa una sequenza molto simile come stampo, quella del cromosoma omologo. I ricercatori possono, quindi, usare CRISPR sia per inattivare i geni dannosi sia per introdurre modifiche mirate.
I NUOVI INTERRUTTORI EPIGENETICI
In entrambi i casi, però, il sistema taglia il DNA e introduce modifiche permanenti. I meccanismi cellulari di riparazione del danno al DNA, su cui si basa, sono molto efficienti ma non infallibili: potrebbero modificare la sequenza in modi imprevedibili, potenzialmente dannosi per la cellula (e quindi per il paziente in caso di applicazione clinica). Per queste ragioni, gli scienziati puntano a realizzare versioni di CRISPR ugualmente efficaci, ma reversibili. I sistemi di nuova generazione non modificano la sequenza dei geni, ma solo il modo in cui vengono letti, e quindi espressi, dalla cellula.
La parola chiave è "epigenetica" , un insieme di modificazioni ereditabili che portano a variazioni dell’espressione genica senza però alterare la sequenza di DNA. Si tratta, in particolare, dell’addizione o rimozione di gruppi chimici – come quello metile (-CH3) – che possono attivare o silenziare i geni o rimodellare la cromatina per renderla più o meno accessibile alla trascrizione.
CRISPRoff, LA VERSIONE 2.0
Lo scopo dei ricercatori statunitensi era quello di “creare una versione 2.0 di Crispr-Cas9, ugualmente efficace ma più sicura”. Il loro CRISPRoff (e la controparte "on") è un interruttore epigenetico, una versione migliorata di due sistemi messi a punto in precedenza dallo stesso gruppo: "CRISPR interference" (CRISPRi) e "CRISPR activator" (CRISPRa). Questi sistemi contengono una proteina Cas9 mutata (dCas9) catalicamente inattiva (di cui avevamo già parlato qui), ossia che lega l’RNA guida, posizionandosi sul DNA ma senza tagliarlo. La proteina dCas9 viene fusa con un enzima "repressore" o "attivatore" dell’espressione genica che agirà sulla sequenza bersaglio.
CRISPRi e CRISPRa hanno però un limite: funzionano solo se la cellula esprime in maniera continuativa gli enzimi necessari per eseguire e mantenere le modificazioni epigenetiche. CRISPRoff, invece, funziona anche con un’espressione transiente – per un tempo limitato – poiché impartisce alla cellula un programma di memoria epigenetica, ereditabile: la modifica del profilo di espressione genica viene tramandata anche alle cellule figlie. In questo sistema, la proteina dCas9 viene fusa insieme a un cocktail di metiltransferasi, enzimi che trasferiscono un gruppo metile al DNA silenziando l’espressione di un gene. La modifica è, inoltre, reversibile: i ricercatori hanno realizzato anche la variante CRISPRon a base di demetilasi, enzimi che rimuovono i gruppi metile e ripristinano l’espressione genica.
ESPERIMENTI SU CELLULE STAMINALI
I ricercatori hanno testato CRISPRoff in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), ossia cellule differenziate che sono state geneticamente riprogrammate per “tornare indietro nel tempo” acquisendo la capacità delle staminali pluripotenti di dare origine a molti tipi cellulari. L’esperimento non solo ha confermato l’efficacia di CRISPRoff come silenziatore genico, ma ha anche dimostrato che le modifiche epigenetiche sono stabili nel tempo per oltre 450 divisioni cellulari. Il gene bersaglio è rimasto spento nel 90% delle iPSC, anche dopo che i ricercatori hanno stimolato il loro differenziamento in neuroni.
PROSPETTIVE FUTURE E LIMITI
Il sistema CRISPRoff è potenzialmente in grado di regolare l’espressione genica di tutti i geni umani. Un’ importante novità rispetto al passato è che la sua attività sembra non essere limitata ai soli geni che presentano isole CpG – regioni con una elevata densità della coppia di basi citosina (C) e guanina (G), prima ritenute necessarie per avviare qualunque meccanismo di metilazione.
Il nuovo sistema potrebbe quindi avere numerose applicazioni a scopo terapeutico. Potrebbe, ad esempio, silenziare l’espressione di un gene associato a una patologia. Per dimostrare le potenzialità di questa strategia, i ricercatori hanno silenziato nei neuroni la proteina Tau, che se mutata provoca gravi malattie neurodegenerative come l’Alzheimer. L’esperimento è stato un parziale successo: ha ridotto, ma non azzerato completamente, l’espressione della proteina.
Rimangono quindi ancora una serie di ostacoli prima di traslare questa strategia in clinica. Una di queste è la somministrazione del sistema CRISPR in un tessuto specifico. La tecnica, anticipano i ricercatori, potrebbe essere molto simile a quella dei farmaci a base di RNA, per cui si stanno ideando metodiche innovative. Un altro limite dello studio, messo in luce dagli autori, è quello di riuscire a produrre una versione migliorata e più precisa dell’RNA guida.
“La ricerca apre comunque le porte a un nuovo modello di CRISPR che cambia le regole del gioco”, ha dichiarato il professor Luke Gilbert, co-autore dello studio. “Poiché per la prima volta scrive un cambiamento nella memoria trascrizionale della cellula che viene tramandato nella divisione cellulare”.
